载脂蛋白E在骨骼肌系统的表达研究*
作者：张慧 范乐明 蔡海江
单位：南京医科大学(210029)动脉粥样硬化研究中心
关键词：载脂蛋白E；骨骼肌；基因表达
心肺血管病杂志990416
摘要 本研究利用骨骼肌合成和分泌非肌性蛋白质，进而分泌入血并在细胞外发挥作用的原理，构建了一个由人巨细胞病毒早期增强子和促进子驱动的人apoEcDNA表达质粒(pCMVapoE)，通过阳离子脂质体介导转染原代培养的小鼠骨骼肌肌母细胞，ELISA和免疫组织化学检测均证实apoE在肌源性细胞成功表达并分泌至培养液中。直接肌肉注射，pCMVapoE表达载体也在小鼠骨骼肌中成功表达，并且预先经氯化钡诱导损伤可使其表达量明显增加。为进一步研究以骨骼肌为靶组织的动脉粥样硬化基因治疗提供了实验依据。
Gene Expression of Apolipoproteins E in Skeletal Muscle
, 百拇医药
Zhang Hui,Fan Leming,Cai Haijiang
Nanjing Medical University,Atheroscleorosis Research Center(210029)
Abstract Non-muscular proteins can be expressed in it and non-muscular proteins could be secreted to the circulation.We constracted a plasmid vector containing the human apoE cDNA,driven by human cytomegalovirus ma jor immediate early enhancer/promoter(pCMV apoE).Primary cultured myoblasts were transfected with pCMV apoE mediated by lipofectamin.The result of both ELISA an d immunocytochemistry showed that apoE expressed in the myocytes and secreted int o the culture medium;pCMV apoE expressed in the skeletal muscle by injection and the expression was increased singnificantly if pre-treated with barium chloride. These results provided some exprimental accordings for atherosclerosis gene the rapy.
, 百拇医药
Key words: Apolipoprotein E; Skeletal muscle; Gene expre ssion
载脂蛋白E(apoE)是人血液中重要的载脂蛋白之一，它几乎涉及到机体各种脂蛋白的代谢，对机体脂质水平影响很大，在胆固醇逆转运(RCT)过程中也发挥了一定作用。已有研究报告用腺病毒载体将人apoE基因转入高胆固醇血症小鼠肝细胞，可使血浆中胆固醇和甘油三酯水平明显降低[1]。将apoE基因转入小鼠动脉壁内皮细胞，也可防止脂纹的形成。目前以骨骼肌为靶组织，采用质粒DNA直接注射被认为是一种简单、经济而又安全的基因转移方法。已广泛应用于核酸疫苗和某些血浆蛋白缺乏症的防治研究。本实验利用骨骼肌合成和分泌非肌性蛋白质在细胞外发挥作用的原理，设想将带有人apoE基因的质粒DNA直接注入骨骼肌中，肌细胞表达的apoE分泌进入血液循环，从而发挥抗动脉粥样硬化的作用。实验首先构建了人apoE表达载体，并转染小鼠肌源性细胞以及直接注入小鼠骨骼肌，观察表达效果，探讨骨骼肌表达apoE的可行性。
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材料与方法
一、apoE质粒表达载体的构建 质粒pUCapoE和pCMVβ由Dickson教授(University of London，UK)惠赠。pUCapoE系人apoEcDNA插入pUC19多克隆位点而成；pCMVβ包括人巨细胞病毒即刻早期增强子和促进子(hCMVE/P)、SV40病毒内含子剪切供体、受体(SD/SA)和SV40病毒polyA信号(SVpA)以及全长大肠杆菌半乳糖苷酶基因(LacZ)。以pCMVβ为母体，将酶切pUCapoE所得apoEcDNA替代其中的LacZ基因，即构成apoE的质粒表达载体pCMVapoE。
二、pCMVapoE扩增及纯化 按《分子克隆》方法，经酚/氯仿抽提过的质粒DNA中除含有pCMVapoE以外还含有大肠杆菌DNA片段。利用PEG8000可沉淀小片段DNA的特点。在质粒DNA沉淀中加入2ml13%PEG8000，5M氯化钠0.4ml,冰浴15h后离心沉淀，以进一步纯化pCMVapoE。
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三、细胞培养[2] 原代肌母细胞取材于出生2～3天的昆明种小鼠四肢，以70%酒精浸泡消毒10min，除去皮肤和骨，剪碎并置于离心管中，加入0.1%胰酶及0.025%胶原酶溶液，37°C消化4～5次，每次15min。收集上清液，加入3～5滴小牛血清终止消化反应。再经过钢丝网筛滤过，细胞计数后以适当的密度接种于培养板。加入含20%小牛血清、100ku/l青霉素、100mg/l链霉素、2mmol/l谷氨酰胺的Ham′sF-10培养液，培养温度37°C，CO2浓度5%。
四、培养细胞的脂质体转染法 细胞转染前30min开始改用无血清培养液，加入一定量的表达质粒与阳离子脂质体Lipofectamin(GibcoBRL产品)的混合物，具体方法按产品说明书进行，转染时间为6h。
五、质粒表达载体的骨骼肌注射 pCMVapoE以生理盐水稀释至1mg/ml的浓度，选用4号针头，从胫前肌下端，以平行于肌肉纵轴的方向进针，缓慢注射，每条肌肉注射量一般不超过100ul。
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六、实验小鼠血清的收集和肌肉表达蛋白的抽提 实验小鼠摘眼球取血，室温下放置30min，离心分离血清。胫前肌剪碎后加入0.5ml组织裂解液[150mMNaCl、10mMTris-Hcl(pH7.4)、50mMEDTA、临用前加1mMPMSF]置于1.5ml匀浆器中研磨成糊状，转移至离心管中，不断漩涡震荡，4°C过夜。次日于4°C，10000rpm离心20min，取上清，-70°C保存。
七、ApoE表达产物的ELISA检测 具体操作按apoEELISA检测试剂盒说明书进行。
八、免疫组织化学染色 细胞接种于6孔培养板内预置的盖玻片上，经转化实验后取出盖玻片，中性福尔马林固定30min。，采用直接法进行细胞染色，再以苏木素复染，树胶封片。小鼠胫前肌实验结束后立即用中性福尔马林固定24h，石蜡包埋及切片。后者经二甲苯脱蜡和系列乙醇脱水处理后，用直接法进行染色，苏木素对比核染色。
九、统计分析 实验数据以X±SD表示，采用配对设计差值t检验。
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结 果
一、apoE在离体培养细胞中的表达 原代培养的昆明种小鼠肌母细胞，生长至第4天进行脂质体转染，转入pCMVapoE作为实验组，转入pCMVβ作为阴性对照组，48h后检测细胞培养液中apoE的含量。结果实验组为2.0±0.1ng/ml(4孔平均值)，而对照组培养液中则检测不到。
免疫组化结果与之一致，实验组6%～8%的细胞胞浆中出现与apoE抗体反应的细小棕色颗粒，染色阳性的细胞变圆，体积也增大，而对照组则无此现象(图1，2)。
图1 pCMVβ通过脂质体介导转入原代肌母
细胞免疫组织化学染色 ×40
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图2 pCMV apoE通过脂质体介导转入原代肌母
细胞免疫组织化学染色 ×40
二、apoE在小鼠骨骼肌中的表达及局部损伤对apoE表达的影响 实验1：4周龄雄性昆明种小鼠12只，右胫前肌注射pCMVapoE100ug作为实验组，左胫前肌注射pCMVβ100ug作为对照组，2周后ELISA检测结果见表1。对照组每条肌肉apoE的表达量为153±33ng/条肌肉，实验组为213±50ng/条肌肉，按配对差值t检验，有显著性差异(P<0.01)，说明pCMVapoE直接肌肉注射，可以在注射部位获得apoE表达。
表1 apoE在小鼠骨骼肌中的表达(X±SD，ng/条肌肉)
pCMVβ100ug
pCMVapoE100ug
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pCMVapoE40ug
1.2%BaCl225ul
+pCMVapoE40ug
n
12
12
11
11
X±SD
153±34
213±50
179±59
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275±135
注：P<0.01与pCMVβ100ug组相比；P<0.05与pCMVapoE40ug组相比 实验2：4周龄雄性昆明种小鼠11只，右胫前肌先注射1.2%氯化钡25ul，3天后左、右胫前肌各注射pCMVapoE40ug，2周后ELISA检测结果见表1。经氯化钡预先处理的肌肉apoE表达量为275±135ng/条肌肉，未经氯化钡处理的肌肉apoE的表达量为178±59ng/条肌肉，前者与后者相比P<0.05。
肌肉免疫组织化学显示，注入pCMVapoE的肌肉，在注入路径附近表达的apoE与HRP标记的抗体反应，呈现条状棕色反应带，而pCMVβ组则无此现象(图3，图4)。
图3 注入pCMVβ的小鼠骨骼肌
, 百拇医药
免疫组织化学染色 ×10
图4 注入pCMVapoE小鼠骨骼肌
免疫组织化学染色 ×10
由于对照组亦有apoE的表达，我们曾怀疑小鼠骨骼肌血液中有鼠apoE干扰，为此曾进行了人、鼠apoE交叉反应性检测，结果表明人、鼠apoE之间无或仅有微弱的交叉反应，实验小鼠肌肉中含有的血液不会影响pCMVapoE表达的人apoE的ELISA检测。对照组肌肉中apoE表达的原因尚待进一步分析。我们采用统计分析中配对设计原则，对结果进行差值t检验，以消除肌肉自身带来的影响。
讨 论
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基因治疗的关键之一是有效的基因转移，目前认为病毒载体效率较高，而质粒DNA因安全、表达时间较长等因素也颇受关注。将表达载体导入机体可以采取不同途径，其中直接注射尤为方便，已广泛应用于骨骼肌、心肌、肿瘤组织等部位。由于骨骼肌量大血管丰富，位于体表易于操作以及广泛存在的T管结构有利于质粒DNA的吸收和表达，因而被认为是表达外源基因的良好靶器官[7]。本实验将apoE的表达质粒转染离体肌细胞或直接注入小鼠骨骼肌，均获得apoE的有效表达；并且通过预先肌肉损伤，可提高注射质粒的表达效率，为进一步研究动脉粥样硬化的基因治疗提供了理论依据。
曾有报道在质粒DNA注射之前先注射0.75%的布比卡因或氯化钡，可增加质粒DNA的表达。肌肉损伤后3天肌管形成，7天肌纤维结构可以重建，21天肌肉损伤即可恢复[3，4]。我们在成年小鼠胫前肌先注射25ul氯化钡，3天后再注射pCMVapoE40ug。2周后检测apoE的表达量比未注射氯化钡的对照组明显增高(P<0.05)。其机理可能是成年小鼠骨骼肌中的干细胞大部分处于稳定状态，它的分裂和融合依赖于外界环境和肌肉自身状态的变化。而布比卡因或氯化钡等化学物质可以增加细胞膜的通透性，使细胞内钙离子浓度增加，导致肌纤维强烈收缩受损。肌肉损伤过程会产生大量激活因子，诱导干细胞分裂，此时大量核质发生转移，外源基因就更容易进入细胞。另外有些研究采用PCR定量分析认为预先经过损伤的肌肉，质粒DNA在其中的表达效率增加[4]。
, 百拇医药
骨骼肌免疫组织化学检测发现apoE表达仅局限于注射路径附近，这也是影响目的基因表达的因素之一。Wolff[5]和Manthopre[6]研究曾发现采用多点注射的方式可提高外源基因的表达。Hickman[7]将500ugpCMVL注入大鼠肝脏，证实多点注射不仅对组织损伤小，而且目的基因的表达亦增加。实验中我们采用两点注射的肌肉切片，可见apoE的表达分布于两条注射路径，因此多点注射使目的基因表达增加的原因可能在于多点注射增加了质粒DNA直接接触的肌细胞的数量，有利于更多细胞吸收表达外源基因。
已有研究表明，在一定范围内质粒的注射剂量与外源基因的表达量呈剂量依赖关系[8]。这一点在本实验中亦得到证实。注射pCMVapoE100ug的实验组apoE的表达量为213±50ng/条肌肉，而注射40ug的实验组apoE的表达量为178±59ng/条肌肉。所以增加质粒DNA的注射量是增加目的基因表达的方式之一。
, 百拇医药
在质粒纯化技术上，本实验未采用传统的氯化铯梯度离心，而选用聚乙二醇(PEG8000)分级沉淀法。因为前者不可避免地会有溴乙锭、氯化铯的污染，溴乙锭是一种很强的诱变剂，氯化铯可诱导肌纤维坏死。琼脂糖凝胶电泳证实经PEG沉淀后，亦可得到纯度较高的质粒DNA。Hom等[9]采用PEG纯化方法，将带有HLA-B蛋白基因的质粒DNA注入肿瘤组织，获得目的基因的有效表达。但Gal[10]研究发现采用PEG纯化的质粒DNA进行心肌内注射时，心肌组织会产生疤痕。因此经PEG沉淀纯化pCMVapoE后，是否影响其在骨骼肌中的表达还需进一步研究。
本实验研究结果表明，apoE可以在骨骼肌中表达，并且有希望通过氯化钡损伤肌肉、抑制炎症反应、增加质粒cDNA的注射剂量以及改进质粒的纯化技术等，提高pCMVapoE的吸收、表达效率，从而增加血液中apoE的水平，发挥其抗动脉粥样硬化的作用。
*本文为江苏省教委自然科学基金资助项目
, 百拇医药
参考文献
1 Stevenson SC,Marshall N J,Teng B,et al.Phenotypic correction of hypercholesterolemia in ApoE-dificient mice by adenovirus-mediated in vivo gene transfer.Arterioscler thromb Vasc Biol,1995,15:479～484.
2 Pinset C,Montarras D.Cell systems for ex vivo studies of myogenesis: a protoc ol for the isolation of stable muscle cell populations from newbron to adult mic e.Cell Bio,1994,199～205.
3 Wells DJ.Improved gene transfer by direct plasmid injection associated with r egeneration in mouse sktetal muscle.FEBS Lett,1993,332:179～182.
, http://www.100md.com
4 Danko I,Fritz JD,Jiaio S,et al.Pharmacological enhancement of in vivo forei gn gene expression in muscle,Gene Therapy.1994,1:114～121.
affecting direct gene transfer into rodent muscle in vivo.Biote chniques,1991,11:474～485.
6 Manthorpe M,Cornefert-F,HartikkaJ,et al.Gene therapy by intramusclar injection of plasmid DNA:studies on firely luciferase gene expression in mice.Hu m Gene Ther,1993,4:419～431.
, 百拇医药
7 Liang HO,Rye KA,Barter PJ,et al.Dissociation of lipid-free apolipoprotein AI from high density lipoproteins.J Lipid Res,1994,35:1187～1197.
8 Wolff JA,Malone RW,Williams P,et al.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo,Sciencs,1990,247:1465～1468.
9 Horn NA,Meek JA,Budahazi G,et al.Cancer gene therapy using plasmid DNA:purifi cation of DNA for human clinical trials.Hum Gene Ther，1995,6:565～573.
10 Gal d,Weir L,Leclerc G.Direct myocardial transfection in two animal models:e valution of parameters affecting gene expression and percutaneous gene delivery. Lab Invest,1993,68:18～25.
(1999-04-01收稿)
(1999-05-04修回), 百拇医药
单位：南京医科大学(210029)动脉粥样硬化研究中心
关键词：载脂蛋白E；骨骼肌；基因表达
心肺血管病杂志990416
摘要 本研究利用骨骼肌合成和分泌非肌性蛋白质，进而分泌入血并在细胞外发挥作用的原理，构建了一个由人巨细胞病毒早期增强子和促进子驱动的人apoEcDNA表达质粒(pCMVapoE)，通过阳离子脂质体介导转染原代培养的小鼠骨骼肌肌母细胞，ELISA和免疫组织化学检测均证实apoE在肌源性细胞成功表达并分泌至培养液中。直接肌肉注射，pCMVapoE表达载体也在小鼠骨骼肌中成功表达，并且预先经氯化钡诱导损伤可使其表达量明显增加。为进一步研究以骨骼肌为靶组织的动脉粥样硬化基因治疗提供了实验依据。
Gene Expression of Apolipoproteins E in Skeletal Muscle
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Zhang Hui,Fan Leming,Cai Haijiang
Nanjing Medical University,Atheroscleorosis Research Center(210029)
Abstract Non-muscular proteins can be expressed in it and non-muscular proteins could be secreted to the circulation.We constracted a plasmid vector containing the human apoE cDNA,driven by human cytomegalovirus ma jor immediate early enhancer/promoter(pCMV apoE).Primary cultured myoblasts were transfected with pCMV apoE mediated by lipofectamin.The result of both ELISA an d immunocytochemistry showed that apoE expressed in the myocytes and secreted int o the culture medium;pCMV apoE expressed in the skeletal muscle by injection and the expression was increased singnificantly if pre-treated with barium chloride. These results provided some exprimental accordings for atherosclerosis gene the rapy.
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Key words: Apolipoprotein E; Skeletal muscle; Gene expre ssion
载脂蛋白E(apoE)是人血液中重要的载脂蛋白之一，它几乎涉及到机体各种脂蛋白的代谢，对机体脂质水平影响很大，在胆固醇逆转运(RCT)过程中也发挥了一定作用。已有研究报告用腺病毒载体将人apoE基因转入高胆固醇血症小鼠肝细胞，可使血浆中胆固醇和甘油三酯水平明显降低[1]。将apoE基因转入小鼠动脉壁内皮细胞，也可防止脂纹的形成。目前以骨骼肌为靶组织，采用质粒DNA直接注射被认为是一种简单、经济而又安全的基因转移方法。已广泛应用于核酸疫苗和某些血浆蛋白缺乏症的防治研究。本实验利用骨骼肌合成和分泌非肌性蛋白质在细胞外发挥作用的原理，设想将带有人apoE基因的质粒DNA直接注入骨骼肌中，肌细胞表达的apoE分泌进入血液循环，从而发挥抗动脉粥样硬化的作用。实验首先构建了人apoE表达载体，并转染小鼠肌源性细胞以及直接注入小鼠骨骼肌，观察表达效果，探讨骨骼肌表达apoE的可行性。
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材料与方法
一、apoE质粒表达载体的构建 质粒pUCapoE和pCMVβ由Dickson教授(University of London，UK)惠赠。pUCapoE系人apoEcDNA插入pUC19多克隆位点而成；pCMVβ包括人巨细胞病毒即刻早期增强子和促进子(hCMVE/P)、SV40病毒内含子剪切供体、受体(SD/SA)和SV40病毒polyA信号(SVpA)以及全长大肠杆菌半乳糖苷酶基因(LacZ)。以pCMVβ为母体，将酶切pUCapoE所得apoEcDNA替代其中的LacZ基因，即构成apoE的质粒表达载体pCMVapoE。
二、pCMVapoE扩增及纯化 按《分子克隆》方法，经酚/氯仿抽提过的质粒DNA中除含有pCMVapoE以外还含有大肠杆菌DNA片段。利用PEG8000可沉淀小片段DNA的特点。在质粒DNA沉淀中加入2ml13%PEG8000，5M氯化钠0.4ml,冰浴15h后离心沉淀，以进一步纯化pCMVapoE。
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三、细胞培养[2] 原代肌母细胞取材于出生2～3天的昆明种小鼠四肢，以70%酒精浸泡消毒10min，除去皮肤和骨，剪碎并置于离心管中，加入0.1%胰酶及0.025%胶原酶溶液，37°C消化4～5次，每次15min。收集上清液，加入3～5滴小牛血清终止消化反应。再经过钢丝网筛滤过，细胞计数后以适当的密度接种于培养板。加入含20%小牛血清、100ku/l青霉素、100mg/l链霉素、2mmol/l谷氨酰胺的Ham′sF-10培养液，培养温度37°C，CO2浓度5%。
四、培养细胞的脂质体转染法 细胞转染前30min开始改用无血清培养液，加入一定量的表达质粒与阳离子脂质体Lipofectamin(GibcoBRL产品)的混合物，具体方法按产品说明书进行，转染时间为6h。
五、质粒表达载体的骨骼肌注射 pCMVapoE以生理盐水稀释至1mg/ml的浓度，选用4号针头，从胫前肌下端，以平行于肌肉纵轴的方向进针，缓慢注射，每条肌肉注射量一般不超过100ul。
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六、实验小鼠血清的收集和肌肉表达蛋白的抽提 实验小鼠摘眼球取血，室温下放置30min，离心分离血清。胫前肌剪碎后加入0.5ml组织裂解液[150mMNaCl、10mMTris-Hcl(pH7.4)、50mMEDTA、临用前加1mMPMSF]置于1.5ml匀浆器中研磨成糊状，转移至离心管中，不断漩涡震荡，4°C过夜。次日于4°C，10000rpm离心20min，取上清，-70°C保存。
七、ApoE表达产物的ELISA检测 具体操作按apoEELISA检测试剂盒说明书进行。
八、免疫组织化学染色 细胞接种于6孔培养板内预置的盖玻片上，经转化实验后取出盖玻片，中性福尔马林固定30min。，采用直接法进行细胞染色，再以苏木素复染，树胶封片。小鼠胫前肌实验结束后立即用中性福尔马林固定24h，石蜡包埋及切片。后者经二甲苯脱蜡和系列乙醇脱水处理后，用直接法进行染色，苏木素对比核染色。
九、统计分析 实验数据以X±SD表示，采用配对设计差值t检验。
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结 果
一、apoE在离体培养细胞中的表达 原代培养的昆明种小鼠肌母细胞，生长至第4天进行脂质体转染，转入pCMVapoE作为实验组，转入pCMVβ作为阴性对照组，48h后检测细胞培养液中apoE的含量。结果实验组为2.0±0.1ng/ml(4孔平均值)，而对照组培养液中则检测不到。
免疫组化结果与之一致，实验组6%～8%的细胞胞浆中出现与apoE抗体反应的细小棕色颗粒，染色阳性的细胞变圆，体积也增大，而对照组则无此现象(图1，2)。
图1 pCMVβ通过脂质体介导转入原代肌母
细胞免疫组织化学染色 ×40
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图2 pCMV apoE通过脂质体介导转入原代肌母
细胞免疫组织化学染色 ×40
二、apoE在小鼠骨骼肌中的表达及局部损伤对apoE表达的影响 实验1：4周龄雄性昆明种小鼠12只，右胫前肌注射pCMVapoE100ug作为实验组，左胫前肌注射pCMVβ100ug作为对照组，2周后ELISA检测结果见表1。对照组每条肌肉apoE的表达量为153±33ng/条肌肉，实验组为213±50ng/条肌肉，按配对差值t检验，有显著性差异(P<0.01)，说明pCMVapoE直接肌肉注射，可以在注射部位获得apoE表达。
表1 apoE在小鼠骨骼肌中的表达(X±SD，ng/条肌肉)
pCMVβ100ug
pCMVapoE100ug
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pCMVapoE40ug
1.2%BaCl225ul
+pCMVapoE40ug
n
12
12
11
11
X±SD
153±34
213±50
179±59
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275±135
注：P<0.01与pCMVβ100ug组相比；P<0.05与pCMVapoE40ug组相比 实验2：4周龄雄性昆明种小鼠11只，右胫前肌先注射1.2%氯化钡25ul，3天后左、右胫前肌各注射pCMVapoE40ug，2周后ELISA检测结果见表1。经氯化钡预先处理的肌肉apoE表达量为275±135ng/条肌肉，未经氯化钡处理的肌肉apoE的表达量为178±59ng/条肌肉，前者与后者相比P<0.05。
肌肉免疫组织化学显示，注入pCMVapoE的肌肉，在注入路径附近表达的apoE与HRP标记的抗体反应，呈现条状棕色反应带，而pCMVβ组则无此现象(图3，图4)。
图3 注入pCMVβ的小鼠骨骼肌
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免疫组织化学染色 ×10
图4 注入pCMVapoE小鼠骨骼肌
免疫组织化学染色 ×10
由于对照组亦有apoE的表达，我们曾怀疑小鼠骨骼肌血液中有鼠apoE干扰，为此曾进行了人、鼠apoE交叉反应性检测，结果表明人、鼠apoE之间无或仅有微弱的交叉反应，实验小鼠肌肉中含有的血液不会影响pCMVapoE表达的人apoE的ELISA检测。对照组肌肉中apoE表达的原因尚待进一步分析。我们采用统计分析中配对设计原则，对结果进行差值t检验，以消除肌肉自身带来的影响。
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基因治疗的关键之一是有效的基因转移，目前认为病毒载体效率较高，而质粒DNA因安全、表达时间较长等因素也颇受关注。将表达载体导入机体可以采取不同途径，其中直接注射尤为方便，已广泛应用于骨骼肌、心肌、肿瘤组织等部位。由于骨骼肌量大血管丰富，位于体表易于操作以及广泛存在的T管结构有利于质粒DNA的吸收和表达，因而被认为是表达外源基因的良好靶器官[7]。本实验将apoE的表达质粒转染离体肌细胞或直接注入小鼠骨骼肌，均获得apoE的有效表达；并且通过预先肌肉损伤，可提高注射质粒的表达效率，为进一步研究动脉粥样硬化的基因治疗提供了理论依据。
曾有报道在质粒DNA注射之前先注射0.75%的布比卡因或氯化钡，可增加质粒DNA的表达。肌肉损伤后3天肌管形成，7天肌纤维结构可以重建，21天肌肉损伤即可恢复[3，4]。我们在成年小鼠胫前肌先注射25ul氯化钡，3天后再注射pCMVapoE40ug。2周后检测apoE的表达量比未注射氯化钡的对照组明显增高(P<0.05)。其机理可能是成年小鼠骨骼肌中的干细胞大部分处于稳定状态，它的分裂和融合依赖于外界环境和肌肉自身状态的变化。而布比卡因或氯化钡等化学物质可以增加细胞膜的通透性，使细胞内钙离子浓度增加，导致肌纤维强烈收缩受损。肌肉损伤过程会产生大量激活因子，诱导干细胞分裂，此时大量核质发生转移，外源基因就更容易进入细胞。另外有些研究采用PCR定量分析认为预先经过损伤的肌肉，质粒DNA在其中的表达效率增加[4]。
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骨骼肌免疫组织化学检测发现apoE表达仅局限于注射路径附近，这也是影响目的基因表达的因素之一。Wolff[5]和Manthopre[6]研究曾发现采用多点注射的方式可提高外源基因的表达。Hickman[7]将500ugpCMVL注入大鼠肝脏，证实多点注射不仅对组织损伤小，而且目的基因的表达亦增加。实验中我们采用两点注射的肌肉切片，可见apoE的表达分布于两条注射路径，因此多点注射使目的基因表达增加的原因可能在于多点注射增加了质粒DNA直接接触的肌细胞的数量，有利于更多细胞吸收表达外源基因。
已有研究表明，在一定范围内质粒的注射剂量与外源基因的表达量呈剂量依赖关系[8]。这一点在本实验中亦得到证实。注射pCMVapoE100ug的实验组apoE的表达量为213±50ng/条肌肉，而注射40ug的实验组apoE的表达量为178±59ng/条肌肉。所以增加质粒DNA的注射量是增加目的基因表达的方式之一。
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在质粒纯化技术上，本实验未采用传统的氯化铯梯度离心，而选用聚乙二醇(PEG8000)分级沉淀法。因为前者不可避免地会有溴乙锭、氯化铯的污染，溴乙锭是一种很强的诱变剂，氯化铯可诱导肌纤维坏死。琼脂糖凝胶电泳证实经PEG沉淀后，亦可得到纯度较高的质粒DNA。Hom等[9]采用PEG纯化方法，将带有HLA-B蛋白基因的质粒DNA注入肿瘤组织，获得目的基因的有效表达。但Gal[10]研究发现采用PEG纯化的质粒DNA进行心肌内注射时，心肌组织会产生疤痕。因此经PEG沉淀纯化pCMVapoE后，是否影响其在骨骼肌中的表达还需进一步研究。
本实验研究结果表明，apoE可以在骨骼肌中表达，并且有希望通过氯化钡损伤肌肉、抑制炎症反应、增加质粒cDNA的注射剂量以及改进质粒的纯化技术等，提高pCMVapoE的吸收、表达效率，从而增加血液中apoE的水平，发挥其抗动脉粥样硬化的作用。
*本文为江苏省教委自然科学基金资助项目
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参考文献
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(1999-04-01收稿)
(1999-05-04修回), 百拇医药